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逆转录-聚合酶链反应实验方法
  • 发布日期:2018-05-31      浏览次数:413
    • 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA转录系统。

      一、反转录酶的选择

      1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。zui适作用温度为37℃。

      2.禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。zui适作用温度为42℃。

      3.Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。

      4.MMLV反转录酶的RNase H-突变体:商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

      二、合成cDNA引物的选择

      1.   随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA*链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。

      2.   Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

      3.   特异性引物:zui特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,*条链的合成可由与mRNA 3’端zui靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。

      三、 试剂准备

      1.RMA提取试剂

      2.*链cDNA合成试剂盒

      3.dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

      4.Taq DNA聚合酶

      四、操作步骤

      1。 总RNA的提取:见相关内容。

      2。 cDNA*链的合成:目前试剂公司有多种cDNA*链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

      ① 在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,轻轻混匀、离心。

      ② 70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

      然后加入下列试剂的混合物:10×PCR buffer  2μl;25mM MgCl2  2μl;10mM dNTPmix 1μl;0.1M DTT  2μl

      轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5min。

      ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。

      ④ 于70℃加热15min以终止反应。

      ⑤ 将管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。

      3.PCR:

      ① 取0.5ml PCR管,依次加入下列试剂:*链cDNA   2μl;上游引物(10pM) 2μl;下游引物(10pM) 2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl) 1μl。

      ② 加入适量的ddH2O,使总体积达50μl。轻轻混匀,离心。

      ③ 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照。

      ④ 电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。

      ⑤ 密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。

      五、注意事项

      1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。

      2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。

      3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

      4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。

      5. 防止DNA的污染:① 采用DNA酶处理RNA样品;② 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。

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